1.的样品测定的准备和使用说明(2015年03月23日)

使用说明：

1.样品检测准备：

一个。细胞或组织样品的制备

对于培养的细胞，先将细胞收集到离心管中，弃去上清液，每100万个细胞加入100-200微升过氧化氢检测裂解液，然后将裂解液加入到裂解液中，充分匀浆至破坏和裂解细胞。4℃离心约3-5分钟，取上清液进行后续测定。以每 5-10 mg 组织 100-200 微升裂解缓冲液的比例将组织样品均质化。4°C 离心约 3-5 分钟，取上清液用于后续检测。上述所有操作都需要在 4°C 或冰上进行。如果不立即进行检测，制备好的细胞或组织样本可以在 -20°C 下冷冻。

湾。培养细胞上清液样品的制备

培养细胞的上清液可直接用于后续检测。

C。血清、血浆或尿液样本的制备：

准备 50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.0。用 50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.0 将样品稀释 50 倍。例如，将 4 微升样品稀释到 196 微升 50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.0 中。稀释后可用于后续检测。

2.标准曲线分析的准备：

一个。过氧化氢标准品的校准：

由于过氧化氢不是很稳定，使用前需要测量过氧化氢的实际浓度进行校准。将浓度为约1M的过氧化氢用水稀释100倍，使过氧化氢的浓度为约10mM，测定A240。A240 可以通过以下任何一种方法确定：

(a) 普通紫外分光光度计法：用紫外分光光度计配比色皿架、2000C、Oneᶜ等仪器，配以石英比色皿。确定比色皿的光路（路径），一般为1cm。用比色皿检测的过氧化氢浓度最接近实际浓度。

(b) 微量紫外分光光度计法：如2000、一号，仪器含超微量检测板µDrop Plate。确定光路：对于2000、一等过氧化氢检测方法，需要取消“自动光路”，此时光路一般为0.1cm；超微检测板µDrop Plate的光路一般为0.@ >05cm。微型紫外分光光度计的具体光程长度请参考仪器参数。

(c) 96孔紫外酶标仪法（必须能检测240nm波长）：根据96孔板的参数确定光路。一般来说，200微升样品的光路是0.552cm（样品体积除以96孔）单孔内的横截面积）。一般推荐使用专用的96孔UV检测板（如96孔UV板）。如果没有紫外检测板，也可以使用一般的96孔板，但由于是非紫外检测板，会有很高的紫外吸收信号。，所以需要设置一孔等量的双蒸水作为空白对照（一般这类96孔板中200μl水的A240约为3.8），计算时必须减去空白对照。

注：以上方法均需设置等体积的双蒸水作为空白对照，计算时减去该空白对照。

浓度计算公式：c=A/(ε×b)。其中：c为样品浓度（单位为mol/L或M）；A为吸光度值；ε为波长相关的摩尔消光系数（单位为L×mol-1×cm-1或M-1×cm-1)，双氧水的摩尔消光系数为43.6M- 1cm-1；b=光程（单位为cm）。

因此：过氧化氢浓度(M)=A240/(43.6×b)；即：过氧化氢浓度(mM)=22.94 X A240/b

从而计算出试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度，并根据实测浓度设置后续的标准曲线。

例：将本试剂盒提供的1M左右的双氧水用双蒸水稀释100倍后，使用96孔酶标仪和普通96孔板进行检测，每孔200微升，每组平行3条。双蒸水对照组平均A240为3.750，双氧水样品组平均A240为3.974，差异为0.224， 200 μl 样品 0.552cm。代入公式，过氧化氢浓度（mM）=22.94×0.224/0.552=9.31，则为本试剂盒提供的实际过氧化氢浓度为 0.931M。

湾。标准曲线的设置：

样品在什么溶液中，标准也应该在什么溶液中稀释，以减少错误。例如，对于细胞样品，标准品应该用过氧化氢检测裂解液稀释，对于培养细胞的上清样品，标准品应该用相应的细胞培养液稀释。标准溶液可稀释至 1、3、10、30、100 μmol/L，或 1、2、5、1 0、20、50、100 μmol/L。初步测定后，可获知样品的浓度范围，可在样品浓度范围附近对标样进行集中测定。

3.过氧化氢浓度的测定：

一个。在冰上或冰水浴中融化过氧化氢检测试剂。

湾。向检测孔或检测管中加入 50 微升样品或标准品。

C。在每个孔中加入 100 微升过氧化氢检测试剂。

d。轻轻摇晃或轻敲以混合，然后在室温 (15-30°C) 下放置 30 分钟。然后立即确定 A560。如果测量 A560 有困难，波长可以选择 540-570nm。

e. 根据标准曲线计算样品中过氧化氢的浓度。

注意：如果样品中过氧化氢浓度过高，可适当稀释后再测定。如果样品中过氧化氢的浓度过低，可以将样品的体积改为100微升过氧化氢检测方法，而标准品也使用100微升，检测试剂仍使用100微升。这样可以提高检测的灵敏度，但缺点是样品需要消耗100微升。